Анализ мочи
Микроскопия мочевого осадка
Определение гемоглобина в моче
При наличии в моче большого количества крови говорят о макрогематурии, небольшая примесь крови — микрогематурия, определяется микроскопическим исследованием — в осадке обнаруживаются эритроциты — или с помощью химических методов.
Гемоглобин выявляют при помощи реакций:
- с гваяковой кислотой;
- с амидопирином;
- с бензидином;
- для экспресс-анализа используют реактивные таблетки или тест-полоски, выпускаемые различными фирмами.
Принцип метода: гемоглобин в кислой среде катализирует реакции взаимодействия перекиси водорода с некоторыми соединениями (гваяковая кислота, амидопирин, бензидин), в результате которых получаются окрашенные соединения: с гваяковой кислотой — синее, с амидопирином — фиолетовое, с бензидином — синее.
Подготовка проб мочи: 1) исследуют свежесобранную и хорошо взболтанную мочу в абсолютно чистой посуде: в постоявшей моче гемоглобин превращается в метгемоглобин, не обладающий способностью переносить кислород, что может послужить причиной ложноотрицательных результатов; 2) концентрируют гемоглобин и освобождают мочу от некоторых сопутствующих веществ (миоглобин, хром, медь, йодид и бромид калия), дающих аналогичный результат реакции, для этого в пробирку наливают 8–10 мл нефильтрованной мочи, приливают 2 мл ледяной уксусной кислоты и 4-5 мл диэтилового эфира; содержимое пробирки встряхивают и оставляют в штативе на несколько минут для отделения уксусно-эфирной вытяжки, в которую переходит гемоглобин; верхний слой (уксусно-эфирный экстракт) используют для проведения реакций.
Проба с гваяковой кислотой
Реактивы: 1) Свежеприготовленный насыщенный раствор гваяковой кислоты: в пробирку вносят щепотку гваяковой кислоты, приливают 2–4 мл 96% этанола и растворяют до цвета крепкого чая; в реакции используют раствор без осадка; 2) 3% раствор перекиси водорода: к 3 частям свежего пергидроля прибавляют 27 частей дистиллированной воды; раствор готовят непосредственно перед использованием.
Ход определения. В пробирку вносят 2–3 мл уксусно-эфирного экстракта, прибавляют 8–10 капель раствора гваяковой кислоты и 8–10 капель раствора перекиси водорода.
Оценка результатов. Наличие в моче гемоглобина приводит к синему окрашиванию проб. При незначительном содержании гемоглобина окрашивание может появиться через несколько минут после начала реакции.
Проба с амидопирином
Реактивы. 1) 5% раствор амидопирина: 0,5 г амидопирина помещают в мерный цилиндр и до объема 10 мл приливают 96% этиловый спирт; 2) 3% раствор перекиси водорода: к 3 частям свежего пергидроля прибавляют 27 частей дистиллированной воды; раствор готовят непосредственно перед использованием.
Ход определения. В пробирку вносят 2–3 мл уксусно-эфирной вытяжки, прибавляют 8–10 капель 5% спиртового раствора амидопирина и 8–10 капель 3% раствора перекиси водорода.
Оценка результата. При наличии в моче гемоглобина развивается фиолетовое окрашивание.
Проба с бензидином
Реактивы: 1) 0,5% раствор бензидина (C12H12N2) в 50% растворе уксусной кислоты (СН3СООН). Годен в течение нескольких дней при хранении в посуде из темного стекла (нужен ежедневный контроль); 2) 3% раствор перекиси водорода (Н2O2).
Ход определения. В пробирку вносят 5–6 капель раствора бензидина, добавляют столько же 3% раствора перекиси водорода и 3–4 капли мочи.
Оценка результата. При наличии в моче гемоглобина смесь в пробирке окрашивается в зеленый или синий цвет.
Примечание. Более концентрированный раствор бензидина может дать положительную реакцию уже при том количестве эритроцитов, которое встречается в нормальной моче.
Модификация постановки реакции.
- На предметное стекло наносят 1 крупинку бензидина, затем 2 капли ледяной уксусной кислоты, 1 каплю мочи и 2 капли 3% раствора перекиси водорода.
- Смесь раствора бензидина и перекиси водорода в равных частях (несколько капель) наносят на обеззоленный фильтр, через который предварительно профильтровано некоторое количество мочи (10—20 мл), и наблюдают за развитием окраски.
- Перекись водорода можно заменить перекисью бария (ВаO2), для чего 0,25 г основного бензидина и 0,1 г перекиси бария растворяют в 5 мл 50% раствора уксусной кислоты. Реактив готовят непосредственно перед использованием.
Отрицательный результат не исключает наличия крови в моче, так как гемоглобин быстро превращается в метгемоглобин, который не обладает каталитическими свойствами.