Определение концентрации гемоглобина

Исследование содержания гемоглобина в крови (гемоглобинометрия) включает определение гемоглобина и его дериватов, которые присутствуют в крови здоровых людей или появляются при различных патологических состояниях. У здоровых людей гемоглобин находится в крови, главным образом, в виде оксигемоглобина, восстановленного гемоглобина и в небольшом количестве — метгемоглобина, карбоксигемоглобина и вердоглобина.

Для определения концентрации гемоглобина наиболее часто применяются колориметрические методики, основанные на том, что присоединение к гему различных химических групп сопровождается изменением окраски.

Унифицированная гемиглобинцианидная методика

Принцип. Гемоглобин окисляется в метгемоглобин (гемиглобин) железосинеродистым калием, который, вступая в реакцию с ацетонциангидрином, образует окрашенный цианметгемоглобин (гемиглобинцианид). Интенсивность окраски раствора цианметгемоглобина пропорциональна содержанию гемоглобина.

Реактивы:

  • 1) трансформирующий раствор: натрия гидрокарбонат (NaHCO3) — 1,0 г;  ацетонциангидрин — 0,5 мг;  калий железосинеродистый (красная кровяная соль, K3[Fe(CN)6)] — 0,2 г; дистиллированная вода — до 1 л. Раствор желтого цвета, прозрачный; при обесцвечивании или появлении осадка непригоден. Реактив считается годным для употребления в течение нескольких месяцев после приготовления при хранении в посуде из темного стекла;
  • 2) стандартный калибровочный раствор гемиглобинцианида промышленного изготовления (лучше от фирмы-лидера на рынке диагностического оборудования). Например, стандартный раствор фирмы «Иммуна» имеет концентрацию гемиглобинцианида 61,23 мг/100 мл, что соответствует концентрации гемоглобина в крови 15,4 г/100мл при разведении в 251 раз. Хранят в холодильнике в незамороженном виде, защищая от света.

Ход определения. В пробирку, содержащую 5 мл трансформирующего раствора, добавляют 0,02 мл крови (разведение в 251 раз). Хорошо перемешивают и оставляют стоять 10 мин. Фотометрируют при длине волны 500—560 им (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против контрольной пробы (трансформирующий раствор). Измеряют в тех же условиях стандартный раствор. Расчет содержания гемоглобина производят по калибровочному графику, построенному по разведениям стандартного раствора гемиглобинцианида в трансформирующем растворе (см. табл. «Приготовление разведений стандартного раствора гемиглобинцианида для построения калибровочного графика»).

Приготовление разведений стандартного раствора гемиглобинцианида для построения калибровочного графика

№ пробирки Стандартный раствор, мл Трансформирующий раствор, мл Концентрация гемоглобина, г/л
1 — 6 Контрольная проба
2 2 4 50
3 4 2 100
4 6 — 150

По оси абсцисс откладывают известные цифры концентрации гемоглобина, а по оси ординат — показатели оптической плотности со шкалы прибора либо рассчитанные по формуле:

Hb (г/л) = Eоп/Eст. × С × К × 0,01,

где Eоп — экстинкция опытной пробы; Eст — экстинкция стандартного раствора; С — концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, мг/100мл; К — коэффициент разведения крови; 0,01 — коэффициент для пересчета в г/л.

Определение гемоглобина гематологическими анализаторами также основано на методе колориметрии. Ход исследования осуществляется согласно инструкции к набору реактивов.

Нормальные величины

У здоровых людей концентрация гемоглобина в крови составляет:

  • мужчины — 132–164 г/л;
  • женщины — 120–145 г/л;
  • новорожденные (кровь из пуповины) — 135–195 г/л;
  • дети 1 года — 110–130 г/л;
  • дети 10–12 лет — 115–145 г/л.

Дневные колебания. Показатели содержания гемоглобина минимальны утром и максимальны вечером. Значимым изменением уровня гемоглобина считается 15 г/л или более.

Клиническое значение. Содержание гемоглобина в крови ниже нормы для данного пола и возраста называют анемией. Согласно критериям ВОЗ, анемия как клинический синдром определяется при снижении концентрации гемоглобина в периферической крови ниже 110 г/л для любого возраста и пола.

Следует иметь в виду, что диагностика анемии не может проводиться лишь на основании определения концентрации гемоглобина в крови. Это исследование только устанавливает факт наличия анемии. Для уточнения ее характера необходимо определение количества эритроцитов, цветового показателя, изучение морфологии эритроцитов и других показателей.