Определение содержания эритроцитов в крови

Принцип. Подсчет количества эритроцитов под микроскопом в определенном количестве квадратов счетной камеры и пересчет на 1 мкл или 1 л крови в соответствии с объемом и разведением крови.

Реактивы:

  • разводящая жидкость — 0,9% раствор натрия хлорида или раствор Гайема: хлорид ртути II (HgCl2) — 0,5 г;
  • натрия сульфат (Na2SO4) — 5 г;
  • натрия хлорид — 1 г;
  • вода дистиллированная — до 200 мл.

Ход определения. Исследуемую кровь необходимо развести в 200 раз. Для этого в пробирку наливают 4 мл разводящей жидкости. В пипетку набирают 0,02 мл крови. Кончик пипетки вытирают фильтровальной бумагой или марлей, кровь выдувают на дно пробирки, а пипетку промывают верхним слоем жидкости, повторно набирая и выдувая ее в пробирку (пипетируя). Содержимое пробирки перемешивают и оставляют до исследования. Эритроциты рекомендуется считать с помощью счетной камеры не позднее 3 ч после взятия крови.

Устройство и подготовка к работе счетной камеры Горяева. Счетная камера Горяева (далее — камера) представляет собой толстое, прозрачное, прямоугольное стекло с двумя сетками, выгравированными на его поверхности. На боковых участках стекла нанесены основные показатели и название камеры. Сетки отделены друг от друга поперечной канавкой, что препятствует затеканию жидкости из одной сетки в другую при ее заполнении. Двумя глубокими продольными канавками сетки отделены от стеклянных прямоугольных пластинок, к которым притираются шлифованные покровные стекла. Поверхность этих пластинок находится на 0,1 мм выше участков камеры, на которые нанесена сетка. Сетка камеры Горяева образована системой разграничительных линий, проведенных взаимно перпендикулярно. Она состоит из 3600 малых квадратов, сторона которых равна 0,05 (1/20) мм; высота камеры, создающаяся при притирании шлифованного покровного стекла, составляет 0,1 мм; площадь — 1/400 мм2; объем — 1/4000 мм3 (мкл); и 225 больших квадратов со стороной 1/5 мм; площадью 1/25 мм2 и объемом 1/250 мм3 (мкл). Длина стороны всей сетки составляет 3 мм, площадь — 9 мм2, объем — 0,9 мм3 (мкл).

Камеру перед работой тщательно моют водой, вытирают насухо; так же подготавливают шлифованное покровное стекло. Камеру Горяева берут в руку. На участок камеры, где нанесена сетка, укладывают шлифованное покровное стекло. Затем стекло берут и другой рукой, при этом нижняя поверхность камеры находится на двух средних пальцах, два вторых пальца придерживают ее спереди. Свободными двумя первыми пальцами притирают шлифованное покровное стекло, плавно продвигая его по поверхности прямоугольных стеклянных пластинок до появления цветных колец Ньютона в местах плотного прилегания (притирания) покровного стекла к поверхности прямоугольных пластинок камеры (это свидетельствует о высоте камеры — 0,1 мм).

Заполнение камеры Горяева. Заполняют счетную камеру разведенной кровью, предварительно несколько раз встряхнув содержимое пробирки. Затем пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой с оплавленным концом отбирают каплю разведенной крови и подносят ее к щели, образующейся между шлифованным стеклом (покровным) и счетной камерой, жидкость заполняет пространство над сеткой. Обычно одну из сеток заполняют для подсчета эритроцитов, другую — для подсчета лейкоцитов. При заполнении камеры следят за тем, чтобы в пространстве над сеткой не было пузырьков воздуха и жидкость не затекала в бороздки.

Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин для оседания эритроцитов.

Подсчет клеток. Не меняя горизонтального положения, камеру помещают на столик микроскопа и с помощью малого увеличения (объектив 8х, окуляр 10х) находят верхний (дальний) левый край сетки (для лучшего контрастирования опускают конденсор и прикрывают диафрагму). Считают эритроциты в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых, т. е. в 80 малых квадратах. Рекомендуется считать клетки в квадратах, расположенных по диагонали сетки. Для того чтобы одни и те же эритроциты, лежащие на линиях, не попали в счет дважды, принято для каждого квадрата, кроме клеток, лежащих внутри квадрата, считать расположенные на двух определенных линиях (например, левой и верхней).

Расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови производят по формуле:

где X — число эритроцитов в 1 мкл крови; а — число сосчитанных эритроцитов; 200 — степень разведения крови; 80 — число просчитанных малых квадратов; 1/4000 — объем малого квадрата в мкл.

Причины ошибок.

  1. Неточность при взятии крови в пипетку.
  2. Неудовлетворительная градуировка пипеток.
  3. Образование сгустка крови.
  4. Неправильное притирание покровного стекла камеры или недостаточная его толщина (менее 0,3 мм).
  5. Подсчет сразу после заполнения камеры, когда клетки еще не успели осесть на дно.
  6. Плохо вымытые и недостаточно высушенные пипетки и пробирки.
  7. Недоброкачественность реактивов, вызывающая гемолиз.
  8. Любое отклонение от правил подготовки камеры, ее заполнения и подсчета клеток.

Примечание. При гемолитических анемиях, В12-дефицитной анемии подсчет эритроцитов следует осуществлять незамедлительно после взятия крови, так как они быстро разрушаются.

Методика автоматического подсчета эритроцитов

Осуществляется с помощью счетчиков и гематологических анализаторов, выпускаемых различными фирмами, например, Becman Coulter (Швейцария), Sysmex (Япония), Hoffman-La Roche (Швейцария), Serono (США) и др.

При работе с гематологическими счетчиками подготовка пробы (разведение) осуществляется вручную. При использовании гематологических анализаторов отбор пробы крови и ее обработка происходят без участия лаборанта.

Принцип работы большинства анализаторов основан на кондуктометрическом методе: определенное количество разведенной изотоническим раствором натрия хлорида или другого электролита крови пропускается через микроотверстие, проходящая через него клетка увеличивает сопротивление между электродами, и возникающий импульс передается на счетное устройство с цифровой индикацией.

Ход исследования выполняется в соответствии с инструкцией, прилагаемой к анализатору.

Нормальные величины. Количество эритроцитов в крови здорового человека, по данным А. И. Воробьева (1985), у мужчин составляет 4,0— 5,1 × 1012/л, у женщин — 3,7—4,7 × 1012/л.

Клиническое значение. Снижение количества эритроцитов (эритроцитопения) — один из основных критериев анемического синдрома. От истинной анемии необходимо отличать гидремию, связанную с увеличением объема плазмы за счет притока тканевой жидкости (например, при схождении отеков). Причинами анемий служат кровопотери, нарушения кроветворения в костном мозге (дефицит железа, фолиевой кислоты, витамина В12, апластические процессы) и повышенный гемолиз. Степень эритроцитопении варьируется и в тяжелых случаях (апластическая анемия, гемолитическая анемия в период криза, В12-дефицитная анемия) может достигать 1 × 1012/л и менее. Кроме этого, уменьшение количества эритроцитов наблюдается при лейкозах, множественной миеломе, неходжскинских лимфомах, системной красной волчанке, ревматоидном артрите, метастазах злокачественных опухолей и др., а также при недостаточном содержании белка в пище, голодании, вегетарианской диете.

Увеличение количества эритроцитов в единице объема крови называется полиглобулией или эритроцитозом. В физиологических условиях полиглобулия наблюдается у новорожденных первые 3 дня жизни (временное сгущение крови в результате потери жидкости организмом при внезапном переходе к легочному дыханию и кожной респирации), у взрослых — при усиленном потоотделении, голодании. При подъемах на большую высоту эритроцитоз обусловлен не сгущением крови, а действительным повышением продукции эритроцитов в связи с гипоксией. Эритроцитозы наблюдаются при патологических состояниях как симптомы целого ряда заболеваний (вторичные эритроцитозы). Вторичные симптоматические эритроцитозы делят на абсолютные и относительные. Причиной абсолютных полиглобулий является реактивное усиление эритропоэза с увеличением массы циркулирующих эритроцитов (при врожденных пороках сердца, хроническом обструктивном бронхите, гипернефроидном раке, гемангиобластоме мозжечка и др.). Сгущение крови без увеличения количества эритроцитов в результате уменьшения объема плазмы при длительной рвоте, диарее, ожогах лежит в основе относительных полиглобулий.

От симптоматических эритроцитозов следует отличать заболевания крови, относящиеся к гемобластозам и протекающие с увеличением количества эритроцитов, а порой лейкоцитов и тромбоцитов (истинная полицитемия).