Унифицированная методика приготовления мазков крови

Подготовка и обработка стекол. Новые чистые стекла могут использоваться после обезжиривания в смеси Никифорова (равные части 96% этилового спирта и эфира). Использованные стекла замачиваются в течение суток в теплом мыльном растворе или растворе стирального порошка (1 столовая ложка порошка на 5 л воды). Через сутки раствор сливают, стекла промывают проточной водой. Затем их снова заливают теплым мыльным раствором или раствором стирального порошка и доводят до кипения, кипятят в этом же растворе 5—10 мин (не более, во избежание помутнения стекол). После охлаждения раствора его снова сливают, прополаскивают стекла проточной водой и каждое стекло промывают щеткой под проточной водой. Обработанные таким образом стекла раскладывают на чистой простыне для высыхания. Чистые стекла для обезжиривания помещают в смесь Никифорова или 96% этиловый спирт на 60 мин, затем вытирают насухо и хранят в чистой посуде с широким горлом. Чистые стекла рекомендуется брать либо пинцетом, либо руками за боковые края.

Приготовление мазков. На сухое подготовленное предметное стекло ближе к короткой стороне наносят стеклянной палочкой (или непосредственно из места укола пальца) небольшую каплю крови. Оставляют стекло в горизонтальном положении и размазывают кровь по стеклу с помощью сухого чистого шлифованного стекла, держа его под углом 45°. Коротким ребром, подождав, пока вся кровь не расплывется по нему, быстро проводят по предметному стеклу. Сильно нажимать на предметное стекло не следует, так как это может привести к повреждению форменных элементов крови. Мазки высушивают на воздухе и маркируют (лучше простым карандашом). Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, достаточной величины, располагаться на расстоянии 1,0—1,5 см от краев стекла, занимать почти всю длину стекла и заканчиваться «метелочкой». Толстые (густо-розового цвета) мазки использовать не следует, так как в них морфология клеток трудноразличима.

Стандартные качественные мазки получаются при использовании автоматических устройств, предназначенных для приготовления мазков и выпускаемых различными фирмами.

Фиксация и окраска мазков крови. Перед окраской мазки крови обычно фиксируют 5–10 мин в метиловом спирте для предотвращения гемолиза, который может произойти при контакте с водой в процессе окрашивания водорастворимой краской или при последующем контакте с водой. Методики фиксации описаны ниже вместе с методиками окраски. Для окраски по Райту и Лейшману фиксация не требуется, так как эти краски содержат метиловый спирт.

Сухие мазки могут храниться в течение 2 дней в сухом теплом месте, в жаркой влажной атмосфере без фиксации они хранятся значительно меньше.

Клетки крови содержат базофильные и ацидофильные структуры, различающиеся по реакции (pH). Ядра являются базофильными и окрашиваются в голубой цвет. Высоко базофильные (кислые) гранулы базофила также синие. Гемоглобин (будучи основным) окрашивается ацидофильно, т. е. в красный цвет. Окраска с помощью комбинации кислых и основных красителей называется окраской по Романовскому и имеет различные модификации (Паппенгейма, Райта, Нохта, Лейшмана, Гимзы, Джейнера и др.). В качестве основного красителя, как правило, используется метиленовый синий, но также применяется и толуидиновый синий. В качестве кислого красителя используются эозин, азур I и азур II.

Критерии хорошей окраски: розовый цвет эритроцитов, фиолетовое окрашивание зернистости нейтрофилов на розовом фоне, нежная азурофильная зернистость моноцитов.

Для разведения краски лучше всего использовать нейтральную свежую дистиллированную воду. Несвежая дистиллированная вода становится кислой из-за захвата углекислого газа из атмосферы. Если дистиллированная вода имеет щелочную реакцию, эритроциты окрашиваются в грязный голубовато-зеленый цвет; та часть лейкоцитов, которая должна окрашиваться голубым цветом, приобретает фиолетовый оттенок, гранулы эозинофилов становятся голубоватыми и зеленоватыми вместо розовых, а гранулы нейтрофилов перекрашиваются. При кислой воде эритроциты окрашиваются в ярко-оранжевый цвет, а ядра лейкоцитов очень бледные. Идеальной является дистиллированная вода с pH 7,0, для сохранения которой применяется ее забуферивание. Можно использовать готовые к употреблению буферные таблетки, растворяемые в дистиллированной воде.

Для окраски мазков костного мозга идеальной является краска с pH 7,4–7,5.

В качестве унифицированных приняты методики окраски по Нохту и Паппенгейму.

Реактивы для фиксации: 1) метиловый спирт или 2) раствор эозин-метиленового синего по Маю-Грюнвальду.

Реактивы для окраски мазков по Нохту: 1) основной раствор азура И: 1 г краски растворяют в 1 л дистиллированной воды, оставляют в посуде из темного стекла на 12—14 дней при комнатной температуре, после чего используют; 2) основной раствор эозина калия: 1 г краски растворяют в 1 л дистиллированной воды, оставляют в посуде из темного стекла на 12—14 дней при комнатной температуре, после чего используют; 3) фосфатный буфер (смесь Вейзе), pH 7,4—7,5: смешивают 0,49 г дигидрофосфата калия (KH2PO4) и 0,909 г гидрофосфата натрия (Na2HPO4) и растворяют в 1 л дистиллированной воды; 4) рабочий раствор азур-эозина: перед употреблением смешивают 25 мл основного раствора азура II, 20 мл основного раствора эозина калия и 55 мл буферного раствора (пропорции красителей могут варьировать, их устанавливают опытным путем при приготовлении свежих партий основных растворов).

Реактивы для окраски мазков по Паппенгейму: 1) раствор эозин-метиленового синего по Маю-Грюнвальду. При отсутствии готового раствора красителя его готовят растворением 1 г сухой краски в 1 л метилового спирта; 2) рабочий раствор азур-эозина по Нохту.

Фиксация мазков. Фиксирующий раствор наливают в кювету либо в широкогорлую посуду с притертой пробкой. Мазки помещают в контейнер, который погружают в кювету или кладут по одному в посуду на 5–10 мин. Контейнер со стеклами вынимают из фиксирующего раствора (или вынимают пинцетом стекла и устанавливают их в штативе) и оставляют на воздухе до полного высыхания.

Окраска по Нохту. Высохшие фиксированные мазки, не вынимая из контейнера, помещают в кювету с рабочим раствором краски на строго определенное время (20–45 мин), которое подбирают опытным путем для каждой партии краски. При отсутствии кюветы с контейнером стекла помещают горизонтально на параллельно положенные две стеклянные палочки («рельсы») мазком кверху и наливают на них по 3–4 мл рабочего раствора краски. Вынимают контейнер со стеклами из кюветы с красителем и помещают в кювету с водопроводной водой (при отсутствии контейнеров краску со стекол смывают водой, не снимая их со стеклянных палочек). Мазки высушивают на воздухе.

Окраска по Паппенгейму. Сухие нефиксированные мазки крови помещают в контейнер и опускают в кювету с раствором Мая—Грюнвальда на 3-5 мин (или на нефиксированный мазок наливают пипеткой 3—4 мл красителя). Контейнер с мазками ополаскивают в кювете с дистиллированной водой, а затем помещают в кювету с азур-эозиновой краской по Нохту на 8–15 мин. На стекла, помещенные на «рельсы», не сливая краситель, добавляют на 1 мин дистиллированную воду, а затем на 8–15 мин наливают на мазок краску, затем краску смывают водой. Мазки высушивают на воздухе.

Окраска по Романовскому—Гимзе. Производится так же, как по Нохту. В качестве красителя используют готовый раствор Романовского—Гимзы, который перед употреблением разводят из расчета 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды. Время окраски устанавливают опытным путем для каждой партии красителя (25–40 мин).

Окраска по Райту. Реактивы. 0,2 г краски Райта (сухой порошок, BDH/E. Merck) растворяют в 100 мл метилового спирта и дают постоять несколько дней. Если эритроциты окрашиваются недостаточно четко, готовят 0,25% или 0,3% раствор.

Ход окраски. На мазок наносят несколько (примерно 8) капель краски, выдерживают 2–3 мин (следят, чтобы краска не высохла), затем наливают на мазок равное количество забуференной воды. Если краска созрела, на поверхности разведенной краски появится пена или пленка с металлическим блеском. Разведенную краску оставляют на мазке на 2—3 мин, а затем смывают буферным раствором или водой. Нельзя допускать, чтобы краска осаждалась на поверхности мазка. Если это произошло, мазок заливают неразведенной краской на 15–20 с и затем еще раз буферным раствором или водой.

Приготовление фосфатного буфера.

Раствор А (0,2 М КН2PO4): 27,2 г соли растворить в 1 л дистиллированной воды.

Раствор Б (0,2 М Na2HPO4): 35,6 г Na2HPO4 × 2Н20 растворить в 1 л дистиллированной воды.

Для получения 100 мл буферного раствора с нужным pH следует слить растворы А и Б в количествах, указанных в таблице. Величину pH проверяют с помощью рН-метра.

Приготовление фосфатного буферного раствора

Раствор, мл Величина pH
6,0 6,5 7,0 7,2 7,4 7,6 8,0
А
 87,9 68,7 48,8 27,4 18,2 11,5 3,1
Б
 12,1 31,3 51,2 72,6 81,8 88,5 96,9

Окраска по Лейшману. Реактивы. 0,15 г сухой краски Лейшмана растворяют в 133 мл абсолютного метилового спирта. Краска должна полностью раствориться, желательно предварительно кристаллы краски растереть в ступке. Хранят краску в бутыли со стеклянной пробкой, не фильтруют.

Ход окраски. Осуществляют подобно окраске по Райту, но с двойным разведением буферного раствора. Несколько капель краски (около 8) наливают на мазок, выдерживают 2 мин. Добавляют двойное количество буферного раствора (16 капель), размешивают покачиванием и оставляют на 7–10 мин. Краску смывают дистиллированной водой за 2–3 секунды. При более длительном смывании окраска ухудшается. Мазки высушивают в штативе на воздухе.

Приготовление толстой капли крови. Три капли крови, нанесенные на предметное стекло на некотором расстоянии друг от друга, расширяют углом чистого предметного стекла до размера в диаметре примерно 1 см, маркируют карандашом, затем подсушивают на воздухе в течение 1–2 ч.

Окраска толстой капли крови. Толстые капли крови не фиксируют. Предметные стекла с хорошо просушенными толстыми каплями располагают на «рельсах» на некотором расстоянии друг от друга и на 8–10 мин наливают на них рабочий раствор азур-эозина по Нохту. Происходит «выщелачивание» эритроцитов. Затем краску сливают и на препараты наливают новую порцию рабочего раствора азур-эозина по Нохту на 30–35 мин. После этого предметные стекла осторожно ополаскивают дистиллированной водой и высушивают.

Автоматическая окраска мазков

Поскольку одной из наиболее востребованных функций в гематологической лаборатории являются приготовление и окраска мазков крови, естественны попытки их автоматизации.

Первая автоматическая система подготовки мазков была разработана компанией Sysmex (Япония) еще в 1990 г., и в настоящее время по всему миру установлено более 1600 систем. Огромный опыт, накопленный за этот период, был использован при разработке системы нового поколения — полностью автоматизированной станции подготовки и окраски мазков SP-1000i производительностью до 120 мазков в час. В SP-1000i реализуется высокая степень стандартизации и качества приготовления мазков благодаря использованию интеллектуального клинового метода, который дает возможность пользователю в зависимости от гематокрита исследуемой пробы регулировать объем наносимого образца крови, величину угла размазывающего лезвия, скорость нанесения и время ожидания, используя при этом от 8 до 16 различных уровней регулирования. Забор крови может осуществляться вручную или автоматически из открытых или закрытых пробирок.


Автоматизированная станция подготовки и окраски мазков SP-1000i компании Sysmex (Япония)

В системе используется до семи гибко настраиваемых протоколов окраски, которые позволяют стандартизировать качество окраски мазков и удовлетворить самые высокие требования. Могут быть использованы следующие протоколы двойной и одиночной окраски: по Май-Грюнвальду—Гимзе, по Романовскому и по Романовскому—Гимзе. Мазки крови окрашиваются в выделенной кассетной системе, которая содержит только один слайд на кассету. При таком способе гарантируется хорошая взаимосвязь мазка крови с окрашивающими реагентами и при этом не происходит испарения метанола из реагента в воздух. Для гарантии хорошей фиксации крови перед окраской в процесс окраски интегрирован отдельный шаг по предварительной фиксации метанола.

Благодаря гибкости протокола окраски можно использовать специальный протокол для окраски костного мозга.