Исследование крови
Цитохимические исследования лейкоцитов
Цитохимические исследования занимают важное место в дифференциальной диагностике гемобластозов. Кроме большого теоретического значения, неоспорима их роль в уточнении различных форм лейкозов. Разработка эффективных методов дифференциальной диагностики и терапии острых лейкозов, особенно острого лимфобластного лейкоза детей, стала возможной только после введения в клиническую практику цитохимических методов диагностики.
Цитохимические исследования проводят в мазках крови, лейкоконцентрата, костного мозга. Они основаны на использовании специфических химических цветовых реакций для определения в клетках различных веществ. При цитохимическом исследовании пользуются полуколичественной оценкой результатов, используя принцип G. Astaldi (1957), основанный на выявлении специфической окраски различной степени интенсивности. В зависимости от нее исследуемые элементы делят на четыре группы: с отрицательной реакцией (—), слабоположительной (+), положительной (++) и резкоположительной (+++).
Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида и дифференцируют их по указанному принципу, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумма этих произведений составляет условные единицы (ед.). Активность ферментов выражают в условных единицах или в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Средний цитохимический коэффициент вычисляют по формуле Кеплоу в модификации Астальди и Верга:
где цифры (1, 2, 3, 4) обозначают интенсивность окраски; буквы (а, б, в, г) — число подсчитанных клеток с определенной интенсивностью окраски (цитохимической реакции).
Метод полуколичественной оценки является ориентировочным, но позволяет сравнить распределение исследуемых веществ в различных клеточных элементах или в одних и тех же клетках при тех или иных патологических состояниях. Следует, однако, иметь в виду, что цитохимический метод может использоваться только в качестве дополнения к другим методам исследования — морфологическим, иммунологическим, цитогенетическим.
Гликоген
За счет гликогена в основном обеспечиваются энергетические потребности клеток. В частности, за счет реакций гликогенолиза образуется энергия, необходимая для осуществления функции фагоцитоза. Локализуется гликоген в цитоплазме клеток. Для цитохимического выявления гликогена чаще всего применяют PAS-реакцию, или ШИК-реакцию (по названию реактива — шифф-йодная кислота).
Положительную ШИК-реакцию могут также давать такие вещества, как гликозаминогликаны, мукополисахариды, гликопротеины, мукопротеи-ны и др. Гликоген можно легко дифференцировать от других веществ пробами со слюной или α-амилазой.
Проба со слюной. Препарат помещают в свежесобранной слюне в термостат при 37 °С на 30 мин, затем его окрашивают вышеописанной методикой. При инкубации препарата αамилаза, содержащаяся в слюне, расщепляет гликоген, и при реакции с реактивом Шиффа розовая окраска на гликоген не развивается'.
Проба с α-амилазой. Препарат помещают в раствор α-амилазы (1 мл профильтрованной амилазы растворяют в 40 мл 0,85% раствора натрия хлорида) на 30 мин в термостат при 37 °С.
Нормальные величины. В мазках периферической крови и костного мозга гликоген содержится в цитоплазме нейтрофилов разной степени зрелости, но преимущественно в более зрелых (в виде обильной мелкой и диффузной зернистости). В цитоплазме мегакариоцитов и тромбоцитов гликоген определяется в виде одиночных крупных зерен. В крови здоровых людей количество интенсивно окрашенных нейтрофилов (+++) колеблется в пределах 2–12 % от общего числа нейтрофилов, средней интенсивности окраски (++) — в пределах 72–90%, слабо окрашенных (+) — от 4 до 18%. СЦК гликогена в нейтрофилах здоровых людей равен 1,71–2,04 (Кост Е. А., 1975), а по данным В. Б. Лецкого (1970) — 2,52. У лиц пожилого и старческого возраста отмечено достоверное снижение СЦК гликогена до 1,98 (Германов В. А., Сергеева Т. М., 1972).
В лимфоцитах здоровых людей гликоген содержится в виде небольшого числа гранул в 10–12% клеток. В мегакариоцитах гликоген обнаруживается в виде гранул (от единичных до 30–50), напоминая скопления кровяных пластинок. Число гликогенположительных мегакариоцитов составляет в среднем 60 % от общего числа мегакариоцитов.
Клиническое значение. Увеличение числа гликогенположительных лимфоцитов4 (до 70–80 %) характерно для лимфопролиферативных заболеваний, особенно для хронического лимфолейкоза (гликоген определяется в виде крупных гранул). Увеличение содержания гликогена в нейтрофилах наблюдается при различных воспалительных процессах, сахарном диабете, истинной полицитемии. Уменьшение отмечается при агранулоцитозах, лучевой болезни, при хроническом миелолейкозе — примерно в 2 раза по сравнению с нормой, особенно при прогрессировании заболевания (общее количество гликогена, определяемое биохимическими методами, может быть даже повышено из-за лейкоцитоза). При тромбоцитопенической пурпуре и симптоматических тромбоцитопениях число гликогенположительных форм мегакариоцитов значительно снижено (после спленэктомии оно восстанавливается до нормальных величин).
В лейкемических клетках при остром миелобластном лейкозе гликоген или не содержится вообще, или распределен диффузно либо в виде мелкой зернистости; при остром лимфобластном лейкозе — в виде крупных гранул, расположенных в цитоплазме вокруг ядра; при остром монобластном лейкозе бластные клетки содержат незначительное количество диффузно окрашиваемого гликогена; при остром эритромиелозе гликоген в виде гранул обнаруживается в эритробластах.
Липиды
Липиды локализуются в цитоплазме клеток, главным образом, в мембранах органелл и обнаруживаются преимущественно в нейтрофильных гранулоцитах. Играют важную роль в проницаемости мембран. Клетки костного мозга и периферической крови содержат простые липиды в виде нейтральных жиров, свободных жирных кислот, а также сложные липиды — фосфолипиды. Цитохимическое исследование основано на применении веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черный судан и др.). Для выявления нейтрального жира применяют судан III, окрашивающий жир в оранжевый цвет. Липоиды лучше выявляются Суданом черным (черное окрашивание). В гематологических исследованиях чаще применяется окраска мазков Суданом III.
См. методики окраски:
Нормальные величины. Липиды содержатся в цитоплазме нейтрофилов в виде обильной зернистости. Большинство нейтрофилов (69–80 %) у здоровых людей окрашивается интенсивно (+++), 18–36 % — дают окраску средней интенсивности (++) и 10 % — слабо окрашены (+). СЦК липидов в нейтрофилах здоровых людей равен 2,65. В меньших количествах липиды в норме обнаруживаются и в моноцитах. В миелобластах обнаружено небольшое количество липидов, в промиелоцитах их больше, и по мере созревания нейтрофилов содержание липидов увеличивается. В клетках лимфатического ряда липиды не выявляются.
Клиническое значение. Повышение СЦК липидов отмечено у лиц старческого возраста. Повышение содержания липидов в нейтрофилах наблюдается при остром миелобластном и монобластном лейкозах, при прогрессировании хронического миелолейкоза. При недифференцированном остром лейкозе бластные клетки содержат липиды в небольшом количестве (2–3 %). Уменьшение СЦК липидов отмечено при лечебном голодании. Снижение содержания липидов в нейтрофилах выявлено при ревматизме, воспалительных процессах. При остром лимфобластном лейкозе липиды в бластных клетках не выявлены.
Пероксидаза (миелопероксидаза)
В организме человека пероксидаза обнаружена в лейкоцитах, тромбоцитах, в молоке, а также в тканях, в которых происходит метаболизм эйкозано-идов. Простетической группой является протогем. В реакции, катализируемой пероксидазой, перекись водорода восстанавливается за счет соединений, выступающих в качестве доноров электронов, таких как аскорбат, хиноны или цитохром С. Реакция, катализируемая пероксидазой, имеет сложный характер и суммарно выглядит следующим образом:
Пероксидаза локализуется преимущественно в специфической зернистости цитоплазмы гранулоцитов, является маркером клеток миелоидной природы. Она отсутствует в лимфоидных клетках. Ввиду специфичности для нейтрофилов, начиная с ранних фаз созревания, фермент получил название миелопероксидаза. Активность пероксидазы подвержена большим колебаниям.
См. методики окраски:
Нормальные величины. В крови здоровых людей активность пероксидазы выявляется преимущественно в цитоплазме гранулоцитов, в меньшей степени и непостоянно — моноцитов. Фермент появляется в клетках на стадиях промиелоцита и более зрелых миелобластов. Лимфобласты не содержат пероксидазу. 3–16% нейтрофилов окрашены резко положительно (+++), 60–90 % — положительно (++), остальные — слабоположительно (+) (Кост Е. А., 1975). СЦК пероксидазы в нейтрофилах здоровых людей равен 2,5 (Лецкий В. Б., 1970). Эозинофилы характеризуются резко положительной реакцией на пероксидазу.
Клиническое значение. В бластных клетках высока активность фермента при остром миелобластном лейкозе. У больных с хроническим миелолейкозом, особенно в терминальной стадии, СЦК снижается до 1,6; слабая активность фермента наблюдается при остром монобластном лейкозе и отсутствует при остром лимфобластном лейкозе. Определение активности миелопероксидазы как маркера миелоидного ряда используется для дифференциальной диагностики острых миелобластных и лимфобластных лейкозов. Снижение активности фермента отмечено при инфаркте миокарда, ревматизме, туберкулезе, опухолях.
Щелочная фосфатаза
Активность щелочной фосфатазы выявляется впервые на стадии метамиелоцита, повышается по мере дифференцировки до сегментоядерного нейтрофила, а затем по мере старения клетки вновь снижается. Активность фермента определяется в специфических гранулах цитоплазмы. Щелочная фосфатаза относится к группе гидролитических ферментов, расщепляет различные фосфорные эфиры в щелочной среде (оптимум pH 9,6), осуществляет гидролиз однозамегценных эфиров ортофосфата. Наиболее распространено определение активности фермента методами азосочетания.
См. методики окраски:
Нормальные величины. У здоровых людей большинство сегментоядерных нейтрофилов являются фосфатазоотрицательными, и только в 20–30 % клеток (Кост Е. А., 1975) (20–40% — по данным Л. В. Козловской и М. А. Мартыновой, 1975) выявлена слабая активность фермента (+). По данным М. Г. Шубина (1980), активность щелочной фосфатазы для здоровых лиц обоего пола составляет 26 ед., т. е. СЦК равен 0,26. Отмечена более высокая активность фермента у женщин по сравнению с мужчинами (соответственно 31,0±0,8 и 21,0±0,7 ед.).
Клиническое значение. Повышение активности фермента в цитоплазме нейтрофилов отмечается при истинной полицитемии, хроническом миелофиброзе, апластических анемиях. Увеличение активности щелочной фосфатазы в цитоплазме нейтрофилов при острых нелимфобластных лейкозах — благоприятный признак, поскольку у таких больных более вероятны ремиссии. Увеличение активности фермента выявлено у детей первого полугодия жизни— 150–159 ед. Активность фермента увеличивается при беременности, при многих воспалительных процессах, хронических заболеваниях печени, инфекциях, злокачественных новообразованиях, диабетическом кетоацидозе, приеме пероральных контрацептивов, болезни Дауна, инфаркте миокарда и др. Резкое снижение активности щелочной фосфатазы (до полного отсутствия) наблюдается при хроническом миелолейкозе, что может служить важным дополнением дифференциальной диагностики хронического миелолейкоза и хронического миелофиброза, а также лейкемоидных реакций по миелоидному типу. Снижение активности фермента наблюдается при вирусных заболеваниях, в том числе инфекционном гепатите, при лучевой болезни, серповидно-клеточной анемии, болезнях соединительной ткани.
Кислая фосфатаза
Активность кислой фосфатазы обнаруживается преимущественно в нейтрофилах и лимфоцитах крови (максимально в нейтрофильных миелоцитах); локализацию связывают с лизосомами цитоплазмы клеток. Кислая фосфатаза является гидролитическим ферментом (оптимум действия при pH 5,2). Для цитохимического исследования обычно используют методы азосочетания. Нафтолфосфаты под воздействием кислой фосфатазы расщепляются с образованием свободного нафтола, который вступает в реакцию с солью диазония. В результате в местах определяемой активности фермента выпадает осадок азокрасителя красного цвета на зеленом фоне.
См. методики окраски:
Нормальные величины. В клетках крови активность фермента обнаруживается в 12% зрелых гранулоцитов и в лимфоцитах. В нейтрофилах периферической крови здоровых людей активность фермента колеблется в пределах 11–72 ед., т. е. СЦК равен 0,386; в лимфоцитах— 25,0–28,8 ед., т. е. СЦК равен 0,286. У детей активность кислой фосфатазы в нейтрофилах выше, чем у взрослых.
Клиническое значение. Активность кислой фосфатазы повышается при острых лейкозах — монобластном и миелобластном, особенно при остром промиелоцитарном лейкозе (в диффузной форме), при острых лимфобластных лейкозах (в гранулярной форме). Повышение активности фермента наблюдается в нейтрофилах при воспалительных процессах (острая пневмония), туберкулезе, инфаркте миокарда, острых хирургических инфекциях, злокачественных опухолях. Повышение активности фермента в лимфоцитах отмечается при хронических тонзиллитах, при различных аллергических заболеваниях, после иммунизации.
Неспецифические эстеразы
Неспецифические эстеразы — это группа ферментов (гидролаз) с невысокой специфичностью, расщепляющих эфиры карбоновых кислот с короткой углеродной цепью. Локализуются в цитоплазме клеток, главным образом, в лизо-сомах. Активность этих ферментов в той или иной степени выявляется во всех видах лейкоцитов (максимально в незрелых гранулоцитах и моноцитах). Наибольшая активность обнаружена в моноцитах крови. Для определения активности ферментов используют различные субстраты (α-нафтилацетат, нафтол-AS-ацетат, нафтол-AS-D-хлорацетат и др.). Под влиянием неспецифических эстераз из субстрата освобождается свободный нафтол, который дает цветное окрашивание с солями диазония.
См.:
- α-Нафтилацетатэстераза. Методика Леффлера (Н. Loffler)
- Кислая α-нафтилацетатэстераза. Методика Кулленкампфа
- Нафтол-AS-ацетатэстераза. Методика Леффлера (Н. Loffler)
- Нафтол-AS-D-хлорацетатэстераза. Методика Молони и др. ( М. С. Moloney et. al)
Дегидрогеназы
Дегидрогеназы — ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции с участием двух субстратов. Ряд из них принимает непосредственное участие в процессах биологического окисления, осуществляя перенос протонов с субстрата, подвергающегося окислению, на другой субстрат. Дегидрогеназы, катализирующие такое восстановление, специфичны как к донору водорода, так и к его акцептору. Дегидрогеназы присутствуют в самых различных клетках и тканях. Они локализуются в цитоплазме и митохондриях, могут быть выявлены цитохимически при экспозиции клеток с соответствующим субстратом, на который дегидрогеназы действуют в присутствии тетразолиевых соединений, способных акцептировать протоны, с образованием нерастворимых окрашенных соединений.
См.:
- Сукцинатдегидрогеназа. Методика Нахласа в модификации Кваглино и Хейхо
- Сукцинатдегидрогеназа. Методика Нахласа в модификации Р. Н. Нарциссова
- α-Глицерофосфатдегидрогеназа (α-ГФДГ). Методика Нахласа в модификации Р. П. Нарциссова
Нормальные величины. У здоровых людей СДГ и α-ГФДГ выявляются в виде гранул синего цвета в нейтрофилах, лимфоцитах, тромбоцитах периферической крови и миелобластах, гранулоцитах, мегакариоцитах, эритро- и нормобластах костного мозга.
СЦК СДГ лимфоцитов составляет 1,10±0,05; α-ГФДГ — 0,80±0,08. У детей активность СДГ выявляется в 46 % лимфоцитов. У взрослых в пунктате костного мозга 88 % недифференцированных клеток имеют активность фермента (+), все ядросодержащие клетки эритроидного ряда и гранулоциты проявляют активность на (+) или (++).
Клиническое значение. Повышение активности СДГ и α-ГФДГ в гранулоцитах обнаружено у больных со злокачественными опухолями. Снижение активности выявляется в лимфоцитах в период приступа бронхиальной астмы, при хроническом лимфолейкозе, в гранулоцитах — при хроническом миелолейкозе.