Исследование функции тромбоцитов

Способность тромбоцитов приклеиваться к поврежденным участкам сосудистой стенки и быстро образовывать в таких местах тромбоцитарную пробку, останавливающую кровотечение, была выявлена еще в конце XX столетия. Формирование тромбоцитарной пробки начинается с адгезии (приклеивания) тромбоцитов к субэндотелиальным структурам сосудистой стенки — базальной мембране. Главным стимулятором адгезии служит коллаген. Тромбоциты доставляются к месту повреждения уже подготовленными к адгезии и агрегации. Тромбоциты подвергаются сложной внутренней перестройке: меняют свою обычную форму на сферическую, выбрасывают длинные нитчатые отростки-псевдоподии. Адгезия тромбоцитов к субэндотелиальным структурам обычно завершается уже через 3–10 с после повреждения сосуда. Одновременно в кровотоке происходит интенсивное склеивание тромбоцитов друг с другом, в результате чего образуются конгломераты, состоящие из 3–20 клеток, которые приклеиваются к первично ад тезировавшим тромбоцитам. В результате гемостатическая пробка быстро увеличивается в объеме и через 1–3 мин заполняет просвет кровоточащего сосуда.

Исследование адгезивно-агрегационной функции тромбоцитов (ААФТ) — важнейшее звено лабораторной диагностики большинства тромбоцитопатий. В настоящее время разработан ряд легко выполнимых и общедоступных методик исследования ААФТ, включающих способы визуальной, микроскопической и аппаратной (использование агрегометров, микрофильтров) регистрации этих функций.

Адгезивная функция тромбоцитов

Известны прямые и непрямые методы оценки адгезивности (ретенции) тромбоцитов (Кост Е. А., 1975; Меньшиков В. В., 1987; Баркаган 3. С., 1988). Прямые заключаются в подсчете тромбоцитов, фиксированных на стандартной (обычно стеклянной) пластине, при нанесении на нее крови или погружении ее в кровь. Непрямые методы основаны на установлении разницы между количеством тромбоцитов в венозной крови и в крови из ранки на коже пальца руки (адгезивность in vivo) или в венозной крови до и после ее контакта с какой-либо поверхностью (адгезивность in vitro). Наибольшее распространение получили методы определения адгезивности тромбоцитов in vitro. За 7–10 дней до проведения исследования целесообразно отменить лекарственные препараты, так как многие из них угнетают функцию тромбоцитов, что может исказить результаты; особенно это касается дипирадола и его производных, ацетилсалициловой кислоты и ее производных, индометацина, фенилбутазона, сульфинпиразона, низкомолекулярных декстранов, трициклических антидепрессантов.

Модифицированная методика оценки ретенции тромбоцитов

Принцип основан на определении количества тромбоцитов, оседающих на стеклянных шариках, при пропускании через колонку со стандартной скоростью определенного объема крови.

Реактивы. 1) 3,8% раствор цитрата натрия; 2) 1% раствор оксалата аммония.

Оборудование: 1) все необходимое для подсчета тромбоцитов в камере Горяева; 2) инфузионный насос, позволяющий отсасывать кровь из шприца емкостью 5–10 мл со скоростью 2 мл/мин; 3) полихлорвиниловая трубка с внутренним диаметром 3,0–3,5 мм; 4) стеклянные или пластиковые сили-конированные шприцы емкостью 5–10 мл; 5) зажимы; 6) стеклянные шарики диаметром 0,2–0,4 мм, промытые в ацетоне.

Подготовка колонки. Отрезок полихлорвиниловой трубки длиной 23–25 см неплотно закрывают с одной стороны зажимом так, чтобы через отверстие не проходили шарики, а с другого конца насыпают в трубку 2,5 г стеклянных шариков.

Ход исследования. Забирают кровь для подсчета тромбоцитов. В шприц набирают 2 мл крови и присоединяют его к колонке со стеклянными шариками (с незакрытого конца). К другому концу колонки подсоединяют инфузионный насос, включают его и пропускают кровь через колонку за 1 мин. Прошедшую через колонку кровь собирают в силиконированную пробирку, перемешивают и отбирают из нее пробу для подсчета числа тромбоцитов.

Расчет. Индекс ретенции (адгезивности) тромбоцитов (Up) вычисляют по формуле:

где А — количество тромбоцитов в крови до пропускания ее через колонку; В — количество тромбоцитов в крови после пропускания ее через колонку.

Нормальные величины. 20–55 %.

Клиническое значение. Уменьшение индекса адгезивности тромбоцитов вплоть до 0 наблюдается при ряде врожденных тромбоцитопатий, наследственном дефекте тромбоцитов (тромбастении Гланцмана), болезнях Бернара–Сулье и Виллебранда, при изменениях в плазме, угнетающих функцию тромбоцитов, при тромбоцитопениях, при вторичных тромбоцитопатиях (множественная миелома, уремия, цирроз печени). В ряде случаев ретенция тромбоцитов может нарушаться при приеме ацетилсалициловой кислоты.

Повышение адгезивности наблюдается при тромбозах (но не в первые часы, когда число адгезивных тромбоцитов может быть снижено за счет их потребления).

Агрегация тромбоцитов

Наиболее распространенные способы оценки агрегации тромбоцитов заключаются в исследовании скорости и степени уменьшения оптической плотности тромбоцитарной плазмы при перемешивании с индукторами агрегации (АДФ, адреналин, коллаген, ристомицин или ристоцетин, бычий фибриноген).

Образование агрегатов тромбоцитов может быть также оценено визуально или с помощью микроскопа.

Качественная макроскопическая методика

Принцип. Визуальное определение наличия или отсутствия агрегатов тромбоцитов при перемешивании в пробирке тромбоцитарной плазмы со стимулятором агрегации.

Реактивы: 1) 3,8% раствор цитрата натрия; 2) раствор АДФ в изотоническом растворе натрия хлорида и буфере Михаэлиса с pH 7,35 в концентрации 20 мкг/мл; 3) 0,85% раствор натрия хлорида или вероналацетатный буфер Михаэлиса с pH 7,35: раствор А — 7,35 г этил барбитуровокислого натрия, 4,86 г ацетата натрия, 250 мл дистиллированной воды; буфер: 250 мл раствора А, 200 мл 4,25% раствора натрия хлорида, 217 мл 0,1 М раствора соляной кислоты, 683 мл дистиллированной воды.

Ход исследования. В пробирку вносят 0,2 мл тромбоцитарной плазмы (лучше со стандартным содержанием тромбоцитов — 250 000 в 1 мкл) и помещают ее в водяную баню при 37 °С. Через 1 мин прибавляют 0,1 мл раствора АДФ и немедленно включают секундомер. Пробирку постоянно покачивают. Отмечают время образования в смеси крупных агрегатов тромбоцитов.

Нормальные величины. 10–60 с.

Клиническое значение. Нарушение агрегации тромбоцитов отмечено при приеме ацетилсалициловой кислоты (вторая волна), в ряде случаев при болезни Бернара–Сулье. При тромбастении Гланцмана агрегации тромбоцитов не происходит. Ложное снижение агрегации происходит после долгого стояния плазмы, при избытке цитрата натрия.

Усиление агрегации тромбоцитов наблюдается при инфаркте миокарда. Ложное повышение агрегации тромбоцитов отмечается в присутствии гепарина.

Количественная фотометрическая методика

Принцип. С помощью агрегометра (агрегатометра), представляющего собой фотометр с присоединенным к нему самописцем, постоянно регистрируются изменения светопропускающей способности тромбоцитарной плазмы при перемешивании с агрегирующими агентами.

Ход исследования, нормальные величины зависят от типа прибора и приводятся в инструкции, прилагаемой к агрегометру.

Клиническое значение описано в инструкции.