Унифицированный количественный метод с пара-диметиламинобензальдегидом

Принцип метода. Уробилиноген при реакции с пара-диметиламинобензальдегидом образует комплекс красного цвета, интенсивность которого пропорциональна концентрации уробилиногена. Для восстановления уробилина в уробилиноген применяют аскорбиновую кислоту и гидроксид железа. Для увеличения специфичности реакции добавляют ацетат натрия.

Реактивы. 1) пара-диметиламинобензальдегид (C8H11NO); 2) концентрированная соляная кислота; 3) реактив Эрлиха: 0,7 г пара-диметиламинобензальдегида растворяют в 150 мл соляной кислоты, приливают 100 мл дистиллированной воды и смешивают. Полученный раствор должен быть бесцветным или слегка желтоватым. Хранят его в посуде из темного стекла, стабилен; 4) насыщенный раствор ацетата натрия: 375 г CH3COONa × ЗН2O или 226 г CH3COONa растворяют в 250 мл теплой дистиллированной воды. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным; хранят при комнатной температуре; 5) аскорбиновая кислота (С6Н8O6); 6) гидроксид натрия (NaOH) : 0,5 г/л раствора; 7) хлорид бария (ВаСl2): 100 г/л раствора; 8) основной калибровочный раствор: 20 мг фенолсульфофталеина (фенолового красного) в 100 мл 0,5 г/л раствора гидроксида натрия. Стабилен при хранении; 9) рабочий калибровочный раствор: готовят разведением основного раствора в 100 раз 0,5 г/л раствором гидроксида натрия. Стабилен в течение недели при 20 °С. Содержит 0,2 мг фенолсульфофталеина в 100 мл, что эквивалентно по окраске раствору уробилиногена с концентрацией 0,345 мг/дл. Оптическая плотность раствора при определении на спектрофотометре при длине волны 562 нм должна быть в пределах 0,380–0,390.

Подготовка исследуемого образца. Исследуют мочу, хранившуюся не более 3 ч. Мутную мочу центрифугируют. При наличии в моче билирубина его осаждают хлоридом бария: 8 мл мочи смешивают с 2 мл 100 г/л раствора ВаСl2 и фильтруют через бумажный фильтр. Конечный результат умножают на 1,25 (поправка на разведение).

Ход определения. В пробирку наливают 10 мл мочи, растворяют в ней 0,1 г аскорбиновой кислоты, в 2 пробирки отбирают по 1,5 мл для опытной и контрольной пробы. В контрольную пробу вносят 4,5 мл свежеприготовленного раствора, состоящего из 1 объема реактива Эрлиха и 2 объемов насыщенного раствора ацетата натрия. Через 5 мин обе пробы фотометрируют против воды при длине волны 500–590 нм (зеленый светофильтр) в кювете с длиной оптического слоя 10 мм (на спектрофотометре при длине волны 562 нм). Рабочий калибровочный раствор измеряют в тех же условиях, что и опытную пробу.

Результаты выражают в единицах Эрлиха (1 ед. соответствует 1 мг уробилиногена).

Концентрацию уробилиногена выражают количеством единиц Эрлиха в 100 мл мочи (Едэ).

Расчет производят по формуле:

где Ео — экстинкция опытной пробы; Ех — экстинкция холостой пробы; Ек — экстинкция калибровочной пробы; 0,346 — концентрация уробилиногена в растворе (0,346 мг/дл), окраска которого эквивалентна окраске калибровочного раствора фенолфталеина; 6,0 — объем пробы (мл); 1,5 — количество мочи в пробе (мл).

Расчет выделения уробилиногена за определенное время производят по формуле:

где V — объем мочи (мл), выделенной за определенный промежуток времени; 1/100 — коэффициент для расчета количества уробилиногена в 1 мл мочи.

См. также: