Методика Кеплоу (Карlow L.)

Принцип. Фермент, содержащийся в специфических гранулах цитоплазмы, расщепляет α-нафтил фосфат с высвобождением α-нафтола, образующего с солями диазония (прочный голубой или прочный фиолетовый) нерастворимый осадок коричневого цвета.

Реактивы: 1) фиксирующий раствор; 10% раствор формальдегида в абсолютном метаноле; 2) матричный 0,2 М пропандиоловый буферный раствор: 21 г 2-амино-2-метил-1,3-пропандиола доводят дистиллированной водой до 1 л. Хранят в холодильнике при 4 °С; 3) рабочий 0,05 М раствор пропандиолового буфера с pH 9,75: 25 мл матричного буферного раствора смешивают с 5 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты и доводят до 100 мл дистиллированной водой. Хранят в холодильнике при 4 °С; 4) α-нафтилфосфат. Можно использовать нафтол-АБ-фосфат, нафтол-АS-TR-фосфат, нафтол-АЭ-В1-фосфат или нафтол-AS-МХ-фосфат; 5) прочный синий RR, ВВ или BBN. Можно использовать прочный фиолетовый LB или отечественные красители диазоль синий 2С, диазоль синий 0,6, 2% раствор метилового зеленого или гематоксилин Майера; 6) инкубационная среда (готовят перед использованием): 35 мг α-нафтилфосфата, 35 мг прочного синего RR, 35 мл буферного раствора.

Приготовление краски «метиловый зеленый». Краска нестойка: под влиянием света и кислорода воздуха частично превращается в метиловый фиолетовый, который экстрагируют хлороформом. 2 г сухой краски «метиловый зеленый» растворяют в мерном цилиндре в 100 мл дистиллированной воды, добавляют 50 мл хлороформа. Смесь взбалтывают несколько раз в течение дня и оставляют на 1–2 сут для экстрагирования. Для докрашивания используют 2% водный раствор метилового зеленого — верхний слой, хлороформ с растворенным в нем метиловым фиолетовым (нижний слой) удаляют.

Качественная краска имеет темно-зеленый цвет, граница между слоями видна неотчетливо. Если после 1–2-суточного экстрагирования граница между слоями отчетлива, нижний слой — интенсивно-фиолетовый, а верхний — светло-зеленый, то краска непригодна.

Приготовление гематоксилина Майера. В 50 мл дистиллированной воды вносят 1 г гематоксилина. Нагревают до кипения и добавляют 50 мл дистиллированной воды, 0,02 г йодата натрия и 5 г алюмокалиевых квасцов. Хорошо перемешивают до растворения, охлаждают и хранят в плотно закрытой емкости при комнатной температуре.

Ход исследования. При приготовлении мазков из венозной крови в качестве антикоагулянта рекомендуется применять гепарин, так как ЭДТА снижает активность щелочной фосфатазы. Высохшие на воздухе мазки фиксируют в 10% растворе формальдегида на метаноле при температуре 0–5 °С в течение 30 с, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают. Наносят на мазки профильтрованную инкубационную смесь на 10–15 мин, промывают проточной водой 30–60 с. Докрашивают 2% раствором метилового зеленого в течение 15 мин или профильтрованным гематоксилином Майера в течение 4–5 мин. Промывают проточной водой в течение 1 мин, высушивают на воздухе.

Примечания.

  1. При невозможности исследования мазков сразу после приготовления их необходимо зафиксировать, и тогда реакция может быть поставлена через несколько дней без ущерба для точности определения.
  2. Наиболее частой причиной ошибок в определении активности фермента является понижение кислотности буферного раствора. При pH 9,3–9,4 реакция не протекает, и клетки остаются неокрашенными даже при наличии активного фермента. Оптимальным является pH 9,5–9,7.

Подсчет. Просматривают 100 зрелых нейтрофилов в тонкой части мазка, где эритроциты лежат отдельно, подсчитывая количество клеток в каждой группе и умножая на степень активности по следующей схеме.

Пример. При подсчете 100 клеток 8 из них не окрасились; 60 окрасились слабо; 20 — умеренно; 10 клеток имеют гранулы, заполняющие клетку; и 2 окрашены интенсивно, так что почти не видно ядра.
Расчет: 8 × 0 + 60 × 1 + 20 × 2 + 10 × 3 + 2 × 4 = 60 + 40 + 30 + 8 = 138 ед.

При подсчете на 100 клеток возможны значения от 0 до 400 ед. Нормальные пределы для этого метода от 20 до 100 ед.

См. также: