Унифицированная методика подсчета количества ретикулоцитов после окраски их непосредственно на стекле или в пробирке

Принцип. Суправитальная окраска красителями, выявляющими зернисто-сетчатую субстанцию ретикулоцитов.

Реактивы. Можно использовать один из следующих красителей: 1) насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном этиловом спирте. Для приготовления абсолютного спирта надо выдержать 96% этанол в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса. На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски; 2) раствор азура 1 по П. Н. Корикову: азур I — 1 г; аммония оксалат — 0,4 г; натрия хлорид — 0,8 г; 96% этиловый спирт— 10мл; дистиллированная вода — 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2–3 дня в термостат при 37 °С и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор хранят в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать; 3) раствор азура II: азур II — 1 г; натрия цитрат — 5 г; натрия хлорид — 0,4 г; дистиллированная вода — 45 мл. Раствор оставляют в термостате при 37 °С на 2 суток, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15–20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

Ход определения. Окраска на стекле. Хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки.

Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски, стеклографом. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте. Наносят каплю крови на мазок краски, готовят из нее топкий мазок и немедленно помещают во влажную камеру на 3–4 мин (можно пользоваться чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты, марли или фильтровальной бумаги). Затем высушивают мазки на воздухе.

В приготовленных таким образом мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-сетчатая субстанция — в синий цвет.

Окраска в пробирке. Методика 1: перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на 1 каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски (реактив 1). В краску добавляют 0,04 мл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Методика 2: в пробирку помещают 0,05 мл раствора краски 3 и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20–30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Методика 3: в пробирку вносят 0,3–0,5 мл раствора краски 2 и 5—6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1–1,5 ч (лучше окрашиваются ретикулоциты при экспозиции 1,5–3 ч). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Подсчет ретикулоцитов. В мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-сетчатая субстанция — в синий или синеватофиолетовый цвет.

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. Необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов (большая точность получается при подсчете 2000–3000 эритроцитов) и отметить среди них количество клеток, содержащих зернисто-сетчатую субстанцию. На практике для большей точности пользуются специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров. При равномерных тонких мазках, в которых эритроциты расположены в один ряд, подбирают такое поле зрения, в котором имеется, например, 50 эритроцитов, и затем просчитывают 20 таких полей зрения.

При отсутствии готового окуляра его можно легко приготовить, для чего отвинчивают окуляр 7×, вкладывают в него кусок бумаги с вырезанным небольшим квадратиком и завинчивают. Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 1000 или на 100 эритроцитов.

См. также: