Методика азосочетания

Принцип определения тот же, что и в методике Кеплоу по определению активности щелочной фосфатазы.

Реактивы:

  1. фиксирующий раствор: 10% раствор формальдегида в 96% этиловом спирте;
  2. нафтол-AS-фосфат (арилилид оксинафтойной кислоты) — C17H14NO5P;
  3. диметилформамид — (CH3)2NCHO;
  4. 0,1 н. раствор натрия ацетата — CH3COONa (1,36 г кристаллической соли растворяют в 100 мл дистиллированной воды);
  5. 2% раствор фуксина в 1 н. растворе соляной кислоты;
  6. 4% раствор нитрита натрия — NaNO2;
  7. 2% раствор метилового зеленого (см. Определение щелочной фосфатазы) или гематоксилин Карацци.

Приготовление инкубационного раствора (ex tempore).

Раствор А. 20 мг нафтол-AS-фосфата растворяют в 0,5 мл диметилформамида и добавляют 40 мл холодного 0,1 н. раствора натрия ацетата.

Раствор Б. В отдельной емкости 8 капель 2% раствора солянокислого фуксина смешивают с 8 каплями 4% раствора нитрита натрия.

Раствор А сливают с раствором Б. Тщательно смешивают, фильтруют. pH раствора должен быть в пределах 5,2–5,4. При необходимости раствор подкисляют несколькими каплями 1 н. раствора соляной кислоты.

Приготовление гематоксилина Карацци. 75 г алюмокалиевых квасцов растворяют в 1200 мл теплой дистиллированной воды. 1,5 г сухого гематоксилина растворяют в 300 мл глицерина, растирая фарфоровым пестиком в ступке, добавляют в первый раствор. 0,3 г йодата калия растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и постепенно приливают к предыдущему раствору.

Ход исследования. Сухие мазки фиксируют холодным спиртовым 10% раствором формальдегида 30 секунд. Быстро промывают в проточной воде и высушивают на воздухе, помещают на 2 ч в инкубационную среду при 37 °С, промывают дистиллированной водой. Докрашивают гематоксилином Карацци в течение 5 мин или 2 % раствором метилового зеленого в течение 15 мин. Промывают в проточной воде и высушивают на воздухе.

Для оценки тартратрезистентности кислой фосфатазы к 30 мл инкубационной среды добавляют 200 мг L-винной кислоты и инкубируют другой зафиксированный мазок в этой среде, в остальном ход определения такой же.

Кислая фосфатаза выявляется в виде красных гранул в протоплазме.

См. также: